İnce tabaka kromatografisinde tekrarlı yürütme tekniğiyle fosfolipid ölçümünün validasyonu

Abstract

Fosfolipidler, hücre zarlarının temel yapısal bileşenleri olmalarının yanı sıra membran akışkanlığı, hücresel sinyal iletimi, enerji metabolizması ve apoptoz gibi birçok biyolojik süreçte görev alan önemli biyomoleküllerdir. Bu nedenle biyolojik örneklerde total fosfolipid miktarının doğru ve güvenilir yöntemlerle belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. Günümüzde toplam fosfolipid tayininde enzimatik-kolorimetrik spektrofotometrik yöntemler yaygın olarak kullanılmakla birlikte, daha düşük maliyetli ve çoklu örnek analizine uygun alternatif yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. İnce tabaka kromatografisi (TLC), uygun optimizasyon ve densitometrik değerlendirme ile bu amaçla kullanılabilecek yöntemlerden biridir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerde total fosfolipid miktarının tayininde kullanılan enzimatik-kolorimetrik spektrofotometrik yöntem ile TLC tabanlı densitometrik yaklaşımın analitik uyumu değerlendirilmiştir. Referans yöntem olarak 570 nm'de ölçüm veren ticari bir fosfolipid analiz kitine dayalı spektrofotometrik yöntem kullanılmış, alternatif yöntem olarak ise silika jel 60 TLC plakaları üzerinde gerçekleştirilen, developing ve CuSO₄-fosforik asit temelli charring sonrası bant yoğunluklarının görüntü analizi ile değerlendirildiği bir yaklaşım uygulanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, TLC analizinde eter ile iki aşamalı developing işleminin etkisi incelenmiştir. Developing uygulanmış plakalarda fosfolipid bantlarının daha keskin, kompakt ve birbirinden daha net ayrıldığı gözlenmiştir. Ayrıca standart miktarındaki artışa paralel olarak bant yoğunluğunda düzenli bir artış elde edilmiştir. Buna karşılık developing uygulanmamış plakalarda bantların daha yaygın, bulanık ve düzensiz olduğu belirlenmiştir. Densitogram sonuçları da bu gözlemleri desteklemiş ve developing işleminin güvenilir kantitatif analiz açısından kritik olduğunu göstermiştir. Yöntem karşılaştırma analizinde toplam 50 eşleştirilmiş ölçüm değerlendirilmiştir. Passing-Bablok regresyon analizinde elde edilen denklem TLC = 0,1134 + 0,9869 × Spektroskopi şeklinde bulunmuştur. Regresyon eğiminin 0,9869 olması ve %95 güven aralığının 0,9435–1,0318 arasında yer alması, yöntemler arasında belirgin oransal sapma bulunmadığını göstermiştir. Kesişim değeri 0,1134 olup %95 güven aralığının -0,0045 ile 0,1951 arasında olması, belirgin sabit bias bulunmadığını ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, TLC ile spektroskopi arasında iyi düzeyde doğrusal uyum bulunduğunu göstermektedir. Bland-Altman analizinde, TLC - Spektroskopi farklarının ortalaması 0,0757 olarak hesaplanmıştır. Bu bulgu, TLC ölçümlerinin spektrofotometrik ölçümlere göre ortalama olarak hafif düzeyde daha yüksek sonuç verme eğiliminde olduğunu göstermektedir. Farkların standart sapması 0,2524; %95 uyum sınırları ise -0,4190 ile 0,5704 arasında bulunmuştur. Analize dahil edilen 50 ölçümün yalnızca 3'ünün (%5,9) bu sınırların dışında kalması, yöntemler arasında pratik açıdan kabul edilebilir uyum bulunduğunu göstermiştir. Ayrıca Bland-Altman regresyonunda eğimin 0,00372 ve p değerinin 0,8803 olması, farkların ölçüm büyüklüğüne bağlı olarak sistematik biçimde değişmediğini ortaya koymuştur. Sonuç olarak, TLC tabanlı densitometrik yaklaşımın total fosfolipid tayininde spektrofotometrik yöntem ile yüksek düzeyde uyum gösterdiği belirlenmiştir. Özellikle eter ile iki aşamalı developing işleminin ayrım kalitesini ve densitometrik değerlendirmeyi belirgin şekilde iyileştirdiği saptanmıştır. Elde edilen bulgular, TLC yönteminin uygun kalibrasyon ve standardizasyon ile total fosfolipid analizinde alternatif veya tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.