NAC69-1 ve NAM-B2 Genlerinin Buğdaydan İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, NAC tipi transkripsiyon faktörlerinden NAC69-1 ve NAM-B2 genlerinin buğdaydan izolasyonu yapılmıştır. Ayrıca bu genlerin buğdayda yüksek düzeyde ifade edilebilmesini sağlamak amacıyla, genler uygun vektörlere klonlanmıştır. NAC69-1 geni yazlık bir buğday çeşidi Triticum aestivum L. cv. (Yüreğir-89)’dan, NAM-B2 geni ise kışlık bir buğday çeşidi, Triticum turgidum spp. durum cv. (Kızıltan-91)’dan izole edilmiştir. Total RNA izolasyonu trizol reaktifi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen RNA’nın kalite ve miktarı spektrofotometre yardımıyla ölçülmüştür. cDNA sentezi için Fermentas’ın RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit’i kullanılmıştır. PZR sonucunda çıkan ürünler %1’lik agaroz jelde yürütülmüş ve beklenen büyüklükte görülen bantlar kesilerek jelden ayrıştırılmıştır. Ayrıştırılan bu genler, CloneJETTM PCR Cloning Kit’te verilen protokole uygun olarak pJET1.2 klonlama vektörüne transfer edilmiştir. Bu vektörde bulunan genler çift yönde sekanslamaya gönderilmiştir. Klonlanan TaNAC69-1 ve TtNAM-B2 genleri NCBI’da bulunan sekanslarla %100 benzerlik göstermiştir. Genler monokot bitkiler için kullanılan ekpresyon vektörlerinden Impact Vector 1.1. (Plant Research International, Wageningen University, UR) ve pAHC25’e aktarılımıştır. Impact Vector 1.1’de Rubisco (Ribulose bisphosphate carboxylase) promoter ve terminatör bulunurken, pAHC25’te ise bar ve uidA (GUS) markör genlerini içermektedir ve her ikisi de ayrı ayrı Ubi1 promotoru ile kontrol edilmektedir. TaNAC69-1 ve TtNAM-B2 genlerini içeren Impact Vector 1.1 ve pAHC25 vektörleri “Obitek-Biolab Biobalistic Gene Transfer System” partikül bombardımanı aracılığıyla buğdaydan izole edilen olgunlaşmamış başak taslaklarına aktarılmıştır